Федеральная целевая программа «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы»

Соглашение о предоставлении субсидии от 27.11.2014 г. № 14.607.21.0095 с Минобрнауки России

Проект «Разработка высокопроизводительного анализатора с многоканальным детектированием для молекулярно-генетических исследований»

На этапе № 5 в период с 01.07.2016 г. по 31.12.2016 г. в соответствии с «План-графиком исполнения обязательств» (ПГ) выполнялись следующие работы:

5.1 Корректировка программной документации на программное обеспечение и эскизной конструкторской документации экспериментального образца Анализатора по результатам исследовательских испытаний.
5.2 Доработка экспериментального образца Анализатора по результатам исследовательских испытаний.
5.3 Разработка методик групповой идентификации микроорганизмов и количественного анализа нуклеиновых кислот для использования Анализатора в медицине.
5.4 Обобщение результатов ПНИ, проверка их соответствия требованиям Технического задания, оценка результативности ПНИ и эффективности результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем.
5.5 Разработка предложений и рекомендаций по использованию и реализации (коммерциализации) результатов ПНИ, вовлечению их в хозяйственный оборот.
5.6 Разработка проекта технического задания на ОКР по теме: «Создание нового типа высокопроизводительного аппаратно-программного комплекса на основе анализа нуклеиновых кислот методом полимеразной цепной реакции в реальном времени для медицины, здравоохранения и биологии».
5.7 Подготовка отчетной документации, оформление патентного формуляра.

Краткое описание основных полученных результатов

Обзор современной научно-технической, нормативной, методической и патентной литературы на этапе № 1 показал, что разрабатываемый Анализатор соответствует современному уровню.
Для решения поставленных в проекте задач осуществлен выбор варианта теплового блока с регулировкой температуры с помощью элементов Пельтье. Согласно ТЗ скорость нагревания (охлаждения) должна быть не менее 3,5°С в секунду, а нагрев крышки теплового блока – 105±2°С. Наиболее критичным параметром теплового блока является высокая скорость нагревания (охлаждения) образца. Для проверки достижения заданной скорости нагревания (охлаждения) не менее 3,5°С в секунду необходимо макетирование теплового блока, который нужно снабдить тепловой крышкой. Согласно ТЗ нагрев крышки теплового блока — 105±2°С.
Для реализации в рамках ПНИЭР предложена схема флуоресцентного детектора. При этом подвод возбуждающего излучения к пробиркам и сбор флуоресценции образцов должен осуществляться с помощью световода. Смена каналов (цветов) должна осуществляться путём смены пар узкополосных интерференционных светофильтров.

На этапе № 2 определены требования, предъявляемые к новым флуоресцентным красителям. Предложены новые схемы синтеза новых флуоресцентных красителей и их азидных производных. Определено необходимое оборудование и выбраны исходные материалы для синтеза и введения новых красителей для анализа нуклеиновых кислот.
Разработаны требования к программному обеспечению и разработаны алгоритмы решения задач программного обеспечения экспериментального образца Анализатора. Предложен следующий состав программного обеспечения: подсистема управления тепловым блоком – амплификатором, подсистема управления оптическим блоком – флуориметром, подсистема синхронизации, подсистема обмена данными с прикладным программным обеспечением, подсистема резервного хранения данных. Предложен следующий состав прикладного программного обеспечения: задание и ведение журнала анализов, задание и сохранение рабочих режимов прибора и алгоритмов обработки, задание паспорта эксперимента, управление прибором в реальном времени. Предложена архитектура информационного программного обеспечения, которая представляет собой сервисно-ориентированную среду, основанную на клиент-серверной модели с явно выделенным сервером хранения данных.
Проведены расчеты по показателям работоспособности, надежности и экономическим показателям экспериментального образца Анализатора. Расчеты работоспособности оптического и теплового блоков уверенно подтверждают возможность выполнения требований технического задания на ПНИЭР. При разработке Анализатора могут быть использованы модули и покупные изделия, которые применяются в анализаторах нуклеиновых кислот АНК. Заимствование некоторых модулей и покупных изделий позволяет добиться удовлетворительных коэффициентов стандартизации и унификации.
Выполнены дополнительные патентные исследования с целью определения патентной чистоты разработки. ИАП РАН является собственником 3 патентов, которые имеют одинаковые названия: «Устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификаций нуклеиновой кислоты». В патентах решены задачи оптимизации конструкции, увеличения точности и достоверности определений при одновременном решении вопроса импортозамещения.

На этапе № 3 были определены требования, предъявляемые к макетам теплового и оптического блоков Анализатора.
Разработаны принципы построения и блок-схемы макета теплового и оптического блоков Анализатора.
Определен состав теплового и оптического блоков Анализатора.
Разработаны печатные платы макета теплового оптического блоков Анализатора.
Разработана эскизная конструкторская документация на макеты теплового и оптического блоков Анализатора.
Выполнена разработка программного обеспечения макета Анализатора. Предложенный состав предусматривает модульную структуру программного обеспечения макета Анализатора:

  • программное обеспечение макета теплового блока;
  • программное обеспечение макета оптического блока со схемой сканирования.

Выбраны алгоритмы решения задачи согласно аппаратным средствам, использованным в каждом блоке:

  • тепловой блок: 6-ти канальный модифицированный ПИД-регулятор;
  • оптический блок: алгоритмы управления двигателями.

Выполнена разработка Программ и методик исследовательских испытаний макета Анализатора. Определены показатели, методы испытаний и форма протоколов.
Изготовлен макет Анализатора.
Проведены исследовательские испытания макета Анализатора.
Разработаны и обоснованы технические решения экспериментального образца Анализатора, обеспечивающие достижение показателей его надежности. Выполнено расчетное определение повышенных показателей надежности Анализатора.
Выполнены дополнительные патентные исследования.

На этапе № 4 были определены требования, предъявляемые к экспериментальному образцу Анализатора.
Разработана эскизная конструкторская документация на экспериментальный образец Анализатора.
Разработано программное обеспечение экспериментального образца Анализатора.
Разработана программная документация на программное обеспечение экспериментального образца Анализатора.
Наработаны наборы реагентов для испытаний экспериментального образца Анализатора.
Разработаны методики калибровки Анализатора для выполнения количественного анализа нуклеиновых кислот.
Разработаны Программа и методики исследовательских испытаний экспериментального образца Анализатора.
Изготовлен экспериментальный образец Анализатора.
Проведены исследовательские испытания экспериментального образца Анализатора по разработанной Программе и методикам исследовательских испытаний, в том числе осуществлена проверка соответствия экспериментального образца Анализатора требованиям техники безопасности и производственной санитарии.
Подготовлена отчетная документация, оформлен патентный формуляр.

На этапе № 5 получены следующие результаты:
Разработан Заключительный отчет о ПНИЭР.
Программная документация на программное обеспечение и эскизная конструкторская документация экспериментального образца Анализатора скорректированы по результатам исследовательских испытаний.
Оформлен Акт доработки экспериментального образца Анализатора.
Разработаны методики групповой идентификации микроорганизмов и количественного анализа нуклеиновых кислот.
Разработаны предложения и рекомендации по использованию и реализации (коммерциализации) результатов ПНИ.
Разработан проект ТЗ на ОКР.
Оформлен патентный формуляр.
Разработана иная отчетная документация, предусмотренная нормативными актами Минобрнауки России.
Разработан отчет о маркетинговых исследованиях.
Разработан бизнес-план.

Оценка элементов новизны научных, конструкторских и технологических решений, информацию о полученных охраноспособных РИД

На этапе № 1 проведены новые теоретические исследования в области анализа нуклеиновых кислот методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. Для детального описания ПЦР впервые предложены аналитическая и имитационная модели процесса амплификации ДНК, в которых ПЦР рассматривается в качестве ветвящегося процесса.
Предложены новые схемы оценки точности, которые позволяют сделать более адекватной интерпретацию результатов количественного анализа ДНК методом ПЦР-РВ, учитывая вероятностную (стохастическую) природу основных процессов, из которых определяющим является стадия отбора пробы. Предложенные схемы оценки могут быть использованы при разработке алгоритмов выявления инфекционных агентов в окружающей среде и клинических образцах при малых концентрациях.
В результате проработки вариантов возможных методических решений анализа нуклеиновых кислот, разработан и оформлен новый документ: «Методики анализа нуклеиновых кислот методом полимеразной цепной реакции в реальном времени». Методики предназначены для выделения ДНК/РНК из проб объектов окружающей среды, управления анализатором, выявления и идентификации биологических агентов методом ПЦР-РВ и обработки результатов измерений, включая качественный анализ, количественный анализ и хранение полученных данных.
Рассмотрена возможность усовершенствования традиционных методов амплификации нуклеиновых кислот в реальном времени. Усовершенствования методов направлены на расширение функциональных возможностей и на повышение точности количественного анализа ПЦР-РВ.

На этапе № 2 разработаны новые флуоресцентные красители, необходимые для реализации проведения многопараметрических исследований, при которых важно определять несколько признаков (мишеней) для анализируемого образца в одном эксперименте (в одной пробирке).
При разработке программного обеспечения (ПО) Анализатора предположено использование распределенной IT-инфраструктуры, основанной на клиент-серверной модели ПО и возможности использования «облачных» технологий. Для повышения устойчивости алгоритмов работы Анализатора предположено использовать подходы к проектированию встраиваемых систем на основе теории конечных автоматов.

На этапах № 1 и № 2 проекта охраноспособные результаты интеллектуальной деятельности не получены.

На этапе № 3 при разработке эскизной конструкторской документации на макеты теплового и оптического блоков и Анализатора в целом использованы трехмерные технологии.
При разработке системы управления каждого блока Анализатора использованы современные аппаратные средства:

  • тепловой блок — микропроцессор SiM3U166 SiliconLaboratoris.Inc.;
  • оптический блок — микропроцессор LPC2387 NXPSemiconductors;
  • цифровая видеокамера с ПЗС матрицей с интерфейсом IEEE 1394b (FireWire) – SonyXCD-V60 – продукт фирмы «Sony».

Согласно ТЗ на ПНИЭР в 2015 г. по результатам исследований и разработок должны быть оформлены 2 публикации в научных журналах.
Статья «Математический анализ кинетических кривых полимеразной цепной реакции» опубликована в журнале ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2016, том 466, № 1, с. 109—113. В работе рассмотрены подходы к математическому анализу кинетических кривых полимеразной цепной реакции (ПЦР). Приведены общие принципы математического анализа процесса ПЦР. Описаны возможные подходы к анализу при помощи аппроксимации кривых ПЦР и функций эффективности разными зависимостями. Предложены несколько моделей ПЦР на основе уравнений химической кинетики. Приведены критерии выбора оптимальных функций для описания эффективности ПЦР разрабатываемого Анализатора.
Статья «Метод бесконтактного измерения температуры в реакторах приборов для проведения полимеразной цепной реакции в реальном времени» опубликована в журнале ПИСЬМА В ЖУРНАЛ ТЕХНИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ. 2016, Т. 42, № 7, С. 53–58.
В этой статье предложен новый метод бесконтактного измерения температуры жидкости на основе флуоресцентных зондов. Метод позволяет измерять температуру реакционной среды в реакторах приборов для полимеразной цепной реакции в реальном времени и может быть использован для оценки динамических температурных параметров разрабатываемого Анализатора.

На этапе № 3 новизна технических решений подтверждена заявкой на изобретение на «Устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификаций нуклеиновой кислоты». Регистрационный номер РИД 2015149676. Дата регистрации заявки о выдаче патента Российской Федерации 19.11.2015 г.
В устройстве использован метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени. Техническим результатом изобретения является увеличение скорости изменения температуры в режиме охлаждения, повышение быстродействия и производительности этого устройства путем сокращения времени анализа.
Согласно ТЗ на ПНИЭР в 2016 г. по результатам исследований и разработок должны быть оформлены 2 публикации в научных журналах.
Статья «Приближенное аналитическое решение простейшей системы кинетических уравнений, описывающих процесс ферментативного синтеза нуклеиновых кислот» опубликована в журнале ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2016, том 470, № 6, с. 728–731.
Статья «Об альтернативном решении простейшей модели ферментативного синтеза нуклеиновых кислот методом гомотопического возмущения» опубликована в журнале ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2016, том 471, № 1, с. 115–117.
В этих статьях выполнена разработка алгоритма аппроксимации кривых ПЦР-РВ для программного обеспечения (ПО) Анализатора на основе аналитических моделей.
В статьях приводятся результаты получения приближенного аналитического решения системы простой модели ПЦР методом гомотопического возмущения. Рассмотренная модель учитывает ферментативную природу процесса синтеза НК и возможность формирования их димеров. В работах впервые получены приближенные аналитические выражения, хорошо воспроизводящие результаты численного решения динамики компонентов реакции в широком диапазоне концентрации субстрата. Модель позволила получить искомую аналитическую функцию первой стадии ПЦР-РВ.

На этапе № 4 новизна технических решений подтверждена заявкой на полезную модель на «Устройство для одновременного контроля в реальном масштабе времени множества амплификаций нуклеиновой кислоты». Регистрационный номер РИД 2016124827. Дата регистрации заявки о выдаче патента Российской Федерации 21.06.2016 г.
Предлагаемая полезная модель решает задачу повышения однородности температуры теплопроводящего элемента с расположенными в нем углублениями для пробирок с реакционными смесями, уменьшения погрешности количественных измерений в результате амплификации в циклическом режиме и уменьшения погрешности определения температуры плавления исследуемых образцов.

На этапе № 5 По результатам исследований и разработок защищена диссертация «Исследование и практическая реализация программно-аппаратных средств проведения полимеразной цепной реакции с наблюдением в реальном времени» по специальности 01.04.01 – Приборы и методы экспериментальной физики.
Принято решение диссертационного совета Д002.034.01 (на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт аналитического приборостроения Российской академии наук (ИАП РАН), 190103, Санкт-Петербург, Рижский пр. 26, приказ 714/нк от 02.11.2012 г) от «29» декабря 2016 г. № 6 о присуждении Петрову Александру Ивановичу, гражданину Российской Федерации, ученой степени кандидата технических наук.
Соискатель Петров Александр Иванович, 1965 года рождения, в 1988 году окончил физический факультет Ленинградского государственного университета по специальности радиофизика. В ИАП РАН работает в должности ведущего электроника с 2002 года по настоящее время.
Диссертация выполнена в ИАП РАН.
Научный руководитель: доктор технических наук, профессор, директор ИАП РАН Курочкин Владимир Ефимович.
Официальные оппоненты:
Русинов Леон Абрамович – доктор технических наук, профессор, заведующий кафедрой автоматизации процессов химической промышленности Санкт-Петербургского государственного технологического института (технического университета);
Белова Ольга Владимировна – кандидат технических наук, доцент кафедры «Вакуумная и компрессорная техника» (Э-5) факультета «Энергомашиностроение» Московского государственного технического университета им. Н.Э. Баумана
дали положительные отзывы на диссертацию.
Целью работы является развитие научно практических основ создания современных программно-аппаратных средств проведения полимеразной цепной реакции с наблюдением в реальном времени.
В диссертационной работе были использованы результаты, полученные в ходе выполнения ПНИЭР RFMEFI60714X0095 при исследовательских испытаниях Анализатора.
Результаты диссертационной работы полностью основаны на материалах, полученных при выполнении ПНИЭР, как в аппаратной, так и программной частях:

  1. Экспериментальное установлены правила определения рабочих параметров (мощность подводимая к элементу Пельтье и время задержки перед началом измерений) теплового блока Анализатора.
  2. Осуществлен синтез оптимального алгоритма первичной обработки сигнала флуоресценции для оптического блока Анализатора.
  3. Создан проблемно ориентированный язык управления экспериментом и автоматный язык управления аппаратной частью Анализатора.
  4. Разработаны алгоритмы вторичной обработки сигналов для многокомпонентного количественного и качественного анализа ПЦР-РВ.
  5. Создано программное обеспечение для анализатора нуклеиновых кислот на методе ПЦР-РВ.
     

Оценка соответствия полученных результатов техническим требованиям к выполняемому проекту и перспектив продолжения работ по проекту

На основании полученных результатов на этапе № 1, сделан вывод о том, что обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему, исследуемую в рамках ПНИЭР, отчет о патентных исследованиях, методики анализа нуклеиновых кислот методом полимеразной цепной реакции в реальном времени, отчет об исследованиях по усовершенствованию методов амплификации нуклеиновых кислот в реальном времени и иная отчетная документация, предусмотренная нормативными актами Минобрнауки России, выполнены в полном объеме в соответствии с требованиями технического задания и плана-графика этапа. Полученные на 1 этапе ПНИЭР результаты позволяют при выполнении следующих этапов ПНИЭР учесть современные достижения отечественной и мировой науки и успешно выполнить полное проектирование Анализатора.

Разработанные на этапе № 2 новые флуоресцентные красители обеспечат в соответствии с ТЗ не менее 6 каналов возбуждения и регистрации флуоресценции и анализ не менее 6 образцов в одном эксперименте (в одной пробирке).
Расчеты работоспособности оптического и теплового блоков уверенно подтверждают возможность выполнения требований технического задания на ПНИЭР, которые соответствует современному мировому уровню.

Результаты разработки, изготовления и проведенных исследовательских испытаний макета Анализатора на этапе № 3 подтверждают возможность выполнения требований технического задания на макет Анализатора.

Результаты разработки, изготовления и исследовательских испытаний экспериментального образца Анализатора на этапе № 4 подтверждают возможность выполнения всех требований технического задания на ПНИЭР, которые соответствует современному мировому уровню. Разработанные методики калибровки Анализатора обеспечат в соответствии с ТЗ выполнение количественных анализов нуклеиновых кислот.

На этапе № 5 получены результаты экспериментальных исследований поставленных в проекте задач: разработаны методики групповой идентификации микроорганизмов и количественного анализа нуклеиновых кислот для использования Анализатора в медицине, разработан проект технического задания на ОКР, оформлен отчет о маркетинговых исследованиях с целью изучения перспектив коммерциализации РИД, полученных при выполнении ПНИЭР, разработан бизнес-план выполнения ОКР и производства разработанной продукции.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что результаты выполненных работ, разработанная документация, экспериментальный образец Анализатора и достигнутые показатели полностью соответствуют требованиям технического задания и плана-графика ПНИЭР. Исполнитель ИАП РАН готов приступить к разработке Анализатора на этапе выполнения ОКР.

ИАП РАН, Рижский пр., 26., Санкт-Петербург, 190103
тел.: (812) 3630719, факс: (812) 3630720, mail: iap@ianin.spb.su

контент: Иванова Н.В. дизайн: Куспанова Б.С.