Событие

В Октябре 2002 года Нобелевская премия в области химии была присуждена за создание методов мягкой ионизации для масс-спектрометрических анализов биологических макромолекул – Electrospray и MALDI. И это глубоко закономерно. Так называемая «Наука о жизни» (Life science) очень далеко шагнула за последнее десятилетие. Ее основные результаты - расшифровка последовательности генома человека, революционный взрыв в создании новых лекарств и понимании биохимических основ жизни. Современная наука о жизни немыслима без масс-спектрометрического анализа, одновременно являющимися и наиболее мощным (скоростным, разрешающим и чувствительным) методом получения информации, и последним приговором, так как не существует более достоверного метода анализа.

Ключем к применению масс-спектрометрии в биохимии являлось создание методов ионизации биоорганических соединений. Судя по формулировке, премия и была присуждена за создание масс спектрометрического метода ионизации биоорганических молекул. Однако, если понимать формулировку Нобелевской комитета буквально, то премия за метод Электроспрей (Electrospray) должна была бы быть присуждена Русской лаборатории, сделавшую и опубликовавшую эту разработку раньше всех на этой планете. Мы как участники этой работы вздохнули и решили, что премия, наверное, учитывает не только влияние на науку, но и практику применения метода. И хотя мы не оспариваем решения Нобелевского комитета, мы бы хотели осветить существенный вклад Русских ученых в этой важной для человечества разработке. Здесь мы излагаем не только изначальную историю открытия метода, но и каскад последующих событий с участием Русских разработчиков метода Электроспрей.

Проблема

С начала шестидесятых годов активно разрабатывались методы ввода нелетучих веществ в масс-спектрометр, поскольку органическая химия, а вслед за ней - биология,  биотехнология, медицина и экология все более настойчиво стремились использовать  масс-спектрометрию,  как наиболее информативный метод решения своих задач.

Наряду с попытками ионизации биоорганических молекул, нанесенных на поверхность, не имевшими аналитической ценности, несколько исследовательских групп в мире практически одновременно начали работы по созданию методов ионизации биоорганических макромолекул, находящихся в растворах (так, как они и существуют в биологических системах). Общая схема метода была ясна: превращение раствора в аэрозоль (туман) и освобождение каким-либо способом  макромолекул от растворителя.

Изначально ученые пытались освободить молекулы от раствора прямо в вакуумной камере масс-спектрометра. В так называемых методах электрогидродинамического распыления (ЭГД-методы) раствор распылялся из капилляра под действием электрического поля в вакууме. В конце семидесятых годов появились также и первые публикации, описывающие «спрей-методы», где распыление раствора (при высокой температуре, или ультразвуком) проводилось при атмосферном или промежуточном давлении, а затем аэрозоль вводился в область высокого вакуума через отверстие (сопло).

Первые шаги

В это время (конец семидесятых), сходными работами занимались и в отделе масс спектрометрии СКБ аналитического приборостроения АН СССР. СКБ в то время было основным разработчиком масс-спектрометрических приборов в нашей стране. С 1964 года в СКБ разработкой «методов ионизации и источников ионов», занимался одноименный сектор под руководством Л.Н.Галль. По предложению Лидии Николаевны в 1976 году в СКБ АП была открыта тема "Стыковка жидкостного хроматографа с масс-спектрометром", в рамках которой и проводились исследования метода ЭГД ввода жидкости в высоковакуумную камеру масс спектрометра.

Справка: Лидия Николаевна Галль- выпускница Радиофизического факультета ЛПИ им. М.И.Калинина, специалист в области физической электроники, д.ф.-м.н., профессор, группа под руководством Л.Н .Галль работала в Институте аналитического приборостроения АН СССР (преемнике СКБ аналитического приборостроения в области масс-спектрометрии) с момента его создания (1977 год).

Тупиковое направление

Как и западные коллеги, Русская группа первоначально пыталась создать метод мягкой ионизации, усовершенствуя метод ЭГД-распыления в вакууме. Усовершенствования отражены в авторских свидетельствах на устройство транспортировки жидкости (№727052 от 14.12.79г.) и источник ионов (№716435 от 22.10.79г.). Результаты работ были обобщены в статье «Рабочие характеристики источника ионов с электрогидродинамическим вводом жидкости в масс-спектрометр», Int. J. Mass Spectrom. & Ion Phys., 1983, 54, p.p.231-235. Несмотря на первоначальный энтузиазм, группа быстро установила, что ЭГД-распыление – тупиковое направление: спектры нелетучих соединений получаются только при зажигании электрического разряда на поверхности жидкости. Стала понятной непригодность метода для аналитических целей.

На верном пути –  альтернативная концепция

В конце семидесятых годов группа концентрируется на теоретической и экспериментальной проработке альтернативной, новой концепции: разделение в пространстве физических процессов получения ионов биополимеров. А именно, распыление раствора биомолекул электрическим полем – при атмосферном давлении, формирование ионного потока в газодинамических струях – при форвакуумном давлении (1-5 мм.рт.ст.), формирование ионного пучка – при высоком вакууме.
С 1980 года большую помощь в экспериментальных исследованиях и оптимизации газодинамического интерфейса оказывали специалисты Института теплофизики СО АН СССР.
В 1982 году была завершена разработка не имевшего в то время аналогов масс-спектрометрического метода анализа биологических макромолекул, авторы метода  дали ему название «Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении», сокращенно – ЭРИ АД. Оптимизация условий получения ионов базировалась на предложенной в 1982 году физической модели процесса экстракции ионов из растворов, правильность которой подтверждена всем экспериментальным опытом использования метода ЭРИ АД (электроспрей) в масс-спектрометрическом анализе.

На действующем масс-спектрометре с двойной фокусировкой МХ1320 был реализован новый источник ионов – интерфейс ХЖ-МС. В 1982 году тема "Разработка инструментальных методов стыковки жидкостного хроматографа с масс-спектрометром" была завершена, в отчете по НИР (номер государственной  регистрации 02830037141, 1982 г.) для демонстрации возможностей метода были приведены примеры масс-спектров нелетучих веществ. В период выполнения темы и по ее результатам были получены два авторских свидетельства: АС №928940 с приоритетом 09.1980г. «Способ ионизции исследуемых веществ и устройство для его осуществления» и АС №1102400 «Устройство для ионизации веществ» с приоритетом 02.1983.  В последнем авторском свидетельстве была полностью описана система интерфейса ЭРИ АД.

Только после получения положительного решения по этой заявке (ноябрь 83г) авторы, по существующему тогда положению, получили разрешение на открытую публикацию результатов. Именно этим и объясняется тот факт, что первая публикация по методу ЭРИ АД была опубликована в ДАН СССР только в апреле 1984 года, т.е. всего на 5 месяцев раньше первой публикации Дж. Фенна по «электроспрею»  (сентябрь 1984 г.).

В конце 1982 – начале 1983 года группа Л.Н. Галль активно развивала возможности метода ЭРИ АД, проверяя его при анализах смесей аминокислот, пептидов, сахаров и других, все более тяжелых биополимеров. Спектры получались чистыми, с минимальным химическим шумом и представляющие каждое анализируемое вещество единственным квазимолекулярным пиком, соответствующим не разрушенному биоорганическому веществу. Особенностью метода ЭРИ АД было формирование газодинамической струи при сравнительно высоком давлении – порядка 1 мм рт. ст., что позволяет, при желании химика-аналитика, разбивать молекулярные ионы на осколки для получения структурной информации (режим столкновительной фрагментации).

Этот результат, полученный в начале 1983 года, был качественным скачком по сравнению с ранее опубликованными данными.

В 1983 году результаты докладывались на Семинаре по аналитической химии (май, г. Новосибирск), на  Международной конференции по динамике разряженных газов (июнь, г. Ленинград) и представлены в докторской диссертации Л.Н.Галль (1983 год).

Рабочая группа Л.Н.Галль

Л.Н.Галль – руководитель, члены группы: В.И.Николаев, В.А.Шкуров, А.П.Щербаков, Н.В.Краснов, А.Н.Веренчиков (с 1982 года). Все члены рабочей группы защитили диссертации по различным аспектам ЭРИ АД МС.  В 1984 году "За создание метода ЭРИ АД МС" В.А.Шкуров и А.Н.Веренчиков были награждены золотой медалью АН СССР для молодых  ученых.

Группа активно работала вплоть до начала перестройки, опубликовав более 20 работ по модели и экспериментальным результатам ЭРИ АД МС. В СКБ АП был разработан и малой серией выпущен масс-спектрометрический комплекс с жидкостным хроматографом ЖХ-МС 3303. Далее работы прекратились из-за ликвидации СКБ АП.

Всего на пять месяцев, но раньше

Нобелевский лауреат по химии 2002 года профессор Джон Фенн в 1983 году приезжал в СССР в Новосибирск на Международную конференцию по газовой динамике разреженных газов, где он декларировал свое намерение заняться электростатическим распылением в атмосфере. В то время наша группа уже имела работающий прибор с новым методом ионизации и исследовала его аналитические свойства и осуществила ряд вышеуказанных приоритетных публикаций.

Основная статья группы Л.Н.Галль в ДАН СССР «Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении – метод масс-спектрометрического анализа биоорганических веществ» опубликована в апреле 1984 года (том 277, №2, с.379-383), первая статья Фенна – в Journal of Physical Chemistry, v.88, №20, September 27, 1984, p.4451-4458, т.е. в том же году, также как и публикации о соединении ХЖ-МС в 1985 году.

В аналитических обзорах 90-х годов эта одновременность не только признавалась, но и подчеркивалась большая полнота результатов русской группы (см., например, R.D.Smith et.al., Anal.Chem.,1990,62,p.883, K.Standing et.al., 1994). При этом в публикациях русской группы всегда присутствовали ссылки на работы Фенна. Досадно, что он никогда, ни в 80-х, ни в 90-х годах не ссылался на наши работы, хотя, безусловно, знал о них. В 1992 году на конференции в Ейле, США,
А. Веренчиков передал Дж. Фенну все ссылки на предыдущие работы группы Л.Н.Галль, но и после этого Фенн не ссылался на них. Видимо, у американских ученых есть свои причины не принимать во внимание сделанное за океаном. Мы склонны думать, что основная причина такой забывчивости Дж. Фенна - в  интересах частной компании Аналитика Бранфорда. Компанией владеет ученик профессора Джона Фена - Крейг Вайтхауз. Источники Электроспрей и патенты на источник были и остаются основной продукцией этой фирмы.

В развитие метода в рамках сотрудничества ИАП АН СССР с Институтом Энергетических проблем химической физики АН СССР (г. Черноголовка) совместно с профессором А.Ф. Додоновым и его аспирантом Игорем Чернушевичем разработана комбинация источника ЭРИ АД (Электроспрей) с ортогональным времяпролетным масс-спектрометром. В разработке непосредственно участвовали уже упомянутые члены рабочей группы из Ленинграда А.Н. Веренчиков и В.А.Шкуров 1985-87 гг.).

Такая разработка будет повторена в США только спустя пять лет. В конце девяностых годов этот метод получит широчайшее коммерческое применение.

В 1988 г. группой Л.Н.Галль, а затем – А.Ф.Додонова получены спектры многозарядных протеинов. К глупости наших исследователей, результаты оставались неопубликованными до защиты кандидатских диссертаций Веренчикова (1990г.) и Чернушевича (1991г.). Считалось, что принципиальная демонстрация многозарядных ионов, как возможностей ионизации ЭРИ АД, уже опубликована в 1984 г. в работе Шкурова и Веренчикова на соискание золотой медали Академии Наук СССР. Публикация Джона Фена в 1988 г. о многозарядных ионах протеинов вызвала чрезвычайный интерес биологов, поскольку показала возможность анализа тяжелых протеинов. Именно эта демонстрация признана поворотным пунктом в истории метода Электроспрей.
В 1991 – 92 годах в России работы по развитию метода ЭРИ-АД и его приложениям были приостановлены и продолжались членами той же группы за рубежом.

Дань уважения

В этой истории пересекаются имена и судьбы и других замечательных и видных ученых разных стран. Прежде всего, работы группы Л.Н.Галль, начатые в 1976 году, были инициированы идеей и желанием чл.-корр. РАН В.Л. Тальрозе создать систему ХЖ-МС, аналогичную ГХ-МС.

В своих работах наша группа во многом опиралась на результаты, опубликованные канадским ученым Джоном Ирибарном, который изобрел метод «аэроспрей» - прямой прообраз метода электроспрей. В начале девяностых Джон Ирибарн провел замечательные разработки для стабилизации коммерческих ионных источников Электроспрей. Позже Джон Ирибарн был прямым руководителем Игоря Чернышевича в фирме Sciex и участвовал в разработке ESI-Q-TOF, Q-STAR и MALDI-Q-STAR.

Очень значима роль Американского ученого Марвина Вестала – изобретателя метода Термоспрей, создателя первого коммерческого прибора Электроспрей с квадрупольным анализатором и изобретателя метода задержанной экстракции MALDI. С 1993 М.Вестал был руководителем Анатолия Веренчикова в фирме Perseptive Biosystems и участвовал в разработке Mariner ESI-TOF и ALDI со столкновительным охлаждением. Канадский профессор Кен Стэндинг участвовал практически во всех описанных событиях.

Без горечи, но с сожалением

Даже отрывочные куски истории показывают, как много достойных людей участвовало в развитие и приложении метода. Действительно, Нобелевскому комитету было сложно принять решение.

Награда досталась заслуженному ветерану, сделавшему много и долго служившему мировой науке и прогрессу человечества. Мы сожалеем только о том, что приоритетные работы русских ученых в разработке метода «Электроспрей» (ЭРИ АД) были как бы полностью проигнорированы и забыты в самой России, хотя в западных обзорах и оригинальных работах 80-х и начала 90-х годов все эти работы представлены и высоко оценивались. И пускай метод называется Электроспрей, а не ЭРИ АД. В конце концов, это не меняет его важность и полезность.

Список основных публикаций:

1. М.Л.Александров, Л.Н.Галль и др. АС №928940 с приоритетом 09.1980г. «Способ ионизции исследуемых веществ и устройство для его осуществления». (М.Л.Александров в этот период был директором Института аналитического приборостроения).

2. М.Л.Александров, Л.Н.Галль и др. АС №1102400 с приоритетом 02.1983. «Устройство для ионизации веществ».

3. M.L.Alexandrov, L.N.Gall, N.V.Krasnov, V.I.Nikolaev, V.A.Pavlenko, V.A.Shkurov. On the Working Characteristics of the Ion Source with Electrohydrodinamic Introduction of Liquids into the Mass Spectrometer. Int. J. Mass Spectrom. & Ion Phys. 1983, v.46, p. 231-235.

4. М.Л.Александров, Л.Н.Галль, В.Я.Иванов, В.И.Николаев. Расчет свободной поверхности проводящей жидкости, находящейся в сильном электрическом поле.  Известия АН СССР, Механика жидкости и газа, 1983, №6, с.165-167.

5. Л.Н.Галль Докторская диссертация. Ленинград, 1983 т.

6. М.Л.Александров, Л.Н.Галль, Н.В.Краснов, В.И.Николаев, В.А.Шкуров. Прямая стыковка микроколоночного жидкостного хроматографа с масс-спектрометром. Биоорганическая химия, 1984, т.10, с.710-711.

7. М.Л.Александров, Л.Н.Галль, Н.В.Краснов, В.И.Николаев, В.А.Шкуров. Экстракция ионов из растворов при атмосферном давлении – новый метод масс-спектрометрического анализа. ДАН СССР, 277, №2, с.379-383.

8. М.Л.Александров, Л.Н.Галль, Н.В.Краснов, В.И.Николаев, В.А.Шкуров. Электрогидродинамический ввод жидких веществ в масс-спектрометр. ЖТФ, 1984, т.54, №8, с.1559-1571.

9. М.Л.Александров, Л.Н.Галль, Н.В.Краснов, В.И.Николаев, В.А.Шкуров. О механизме образования ионов при электрогидродинамическом распылении жидкости в вакуум.  ЖАХ.,1984, т.39, с.1596-1602.

10. Л.Н.Галль, Н.В.Краснов, Ю.С.Куснер, В.И.Николаев. Формирование распределения кластированных ионов в молекулярном пучке. Письма в ЖЭТФ, 1985, т.41, с.203-206.

11. М.Л.Александров, Л.Н.Галль, Н.В.Краснов, В.И.Николаев, В.А.Шкуров. Метод масс-спектрометрического анализа труднолетучих термически нестабильных веществ, основанный на экстракции ионов из растворов при атмосферном давлении.  ЖАХ, 1985, т.40, №9, с.1560-1567.

12. Л.Н.Галль, М.Я.Туркина.  Возможности масс-спектрометрического анализа нелетучих и термически нестабильных биоорганических соединений. (Обзор) Успехи химии, 1985, т.65, №5, с.741-745.

13. М.Л.Александров, Л.Н.Галль, Г.И.Барам, М.А.Грачев, В.И.Николаев и др.  Форирование пучков квазимолекулярных ионов пептидов из растворов. Биоорганическая химия, 1985, т.11, №5, с.700-704.

14. М.Л.Александров, Л.Н.Галль, Г.И.Барам, М.А.Грачев, В.И.Николаев и др. Новый массспектрометрический метод определения аминокислотной последовательности пептидов. Биоорганическая химия, 1985, т.11, №5, с.705-708.

15. М.Л.Александров, Л.Н.Галль, Н.В.Краснов, В.И.Николаев, В.А.Шкуров.  Управляемая фрагментация органических молекул в масс-спектрометрии с экстракцией ионов из раствора при атмосферном давлении.     Сб. «Масс-спектрометрия и химическая кинетика», ред. В.Л.Тальрозе. М., Наука, 1985, с.304-313.

16. М.Л.Александров, Л.Н.Галль, Н.В.Краснов, В.И.Николаев, В.А.Шкуров, А.Н.Веренчиков. Масс-спектрометрия с ионизацией при атмосферном давлении. Сб. «Масс-спектрометрия и химическая кинетика», ред. В.Л.Тальрозе. М., Наука, 1985, с.314-319.

17. M.L.Alexandrov, L.N.Gall, N.V.Krasnov, V.I.Nikolaev, V.A.Shkurov. Method of Mass Spectrometry with Ion Extraction from Solutions at Atmosphere Pressure.  Adv. in Mass Spectromety, 1986, v.10B, p.1033-1034.

18. Л.Н.Галль, Н.В.Краснов, Л.Р.Локшин, А.В.Чуприков. Регистрация кластерных ионов вторично-электронным умножителем в масс-спектрометрическом эксперименте. Письма в ЖТФ, 1989, т.15, №21, с.50-54.

19. M.L.Alexandrov, L.N.Gall, A.N Verenchikov, N.V.Krasnov, V.I.Nikolaev, V.A.Shkurov. Mechanism of Ion Formation in STK AP Mass Spectrometry.   Adv. in Mass Spectrometry, 1989, v.11A, p.788-789.

20. L.N.Gall, A.S.Berdnikov.    Analisis of High Molecular Compound Mass Spectra Taking Isotopic Ratios into Account.       Adv. in Mass Spectromety, 1989, v.11B, p.1536-1537.

21. M.L.Alexandrov, L.N.Gall, N.V.Krasnov, L.R.Lokshin, A.V.Chuprikov.  Discriminaton Effects in Inorganic Ion-Cluster Detection by Secondary Electron Multiplet in Mass Spectrometry Experiments.  Rapid Communication in Mass Spectrometry, 1990, v.4, №1, p.9-12.

22. M.L.Alexandrov, L.N.Gall, N.V.Krasnov, L.R.Lokshin, A.V.Chuprikov. Abnormal Effects in the Detection of Ion from Bioorganic Substance by Mass Spectrometry. Rapid Communication in Mass Spectrometry, 1990, v.4, №1, p.12-15.

23. М.Л.Александров Л.Н.Галль, А.Н.Веренчиков Н.В.Краснов, В.А.Шкуров. Исследование механизма образования катионов в масс-спектрометрии ЭРИ АД.   Научное приборостроение , 1991, т.1, №2, с.3-36.

24. L.N.Gall, N.V.Krasnov, L.R.Lokshin, M.Z.Muradymov.  Negative Cluster Ions Registration in Mass Spectrometric Experiments. Rarefield Gas Dynamics, Ed. A.E.Beylich, VCH, 1991, p.1175-1178.

25. Л.Н.Галль, М.З.Мурадымов. Факторы, влияющие на определение микропримесей методом масс-спектрометрии с ионизацией при атмосферном давлении. ЖАХ, 1998.